Amilase >>> faktor-faktor yang mempengaruhi kerjanya

PENGUJIAN AKTIVITAS AMILASE

A.      TUJUAN

Tujuan dilakukannya percobaan ini, yaitu  agar mahasiswa dapat melakukan pengujian aktivitas amilase.

B.       TINJAUAN PUSTAKA

Pati yang juga merupakan simpanan energi di dalam sel-sel tumbuhan ini berbentuk butiran-butiran kecil mikroskopik dengan berdiameter berkisar antara 5-50 nm. Pati umumnya akan terbentuk dari dua polimer molekul glukosa yaitu amilosa (amylose) dan amilopektin (amylopectin). Amilosa merupakan polimer glukosa rantai panjang yang tidak bercabang sedangkan amilopektin merupakan polimer glukosa dengan susunan yang bercabangcabang (Irawan, 2007). Pati merupakan polimer yang tersusun dari unit satuan α-D-glukosa yang dihubungkan oleh ikatan α-1,4 glikosidik dan ikatan α-1,6 glikosidik pada percabangan rantainya. Secara alami, pati merupakan campuran dari amilosa dan amilopektin yang kedua-duanya merupakan suatu polimer dari α-D-glukosa (Sukandar, 2011).

Enzim adalah molekul biopolimer yang tersusun dari serangkaian asam amino dalam komposisi dan susunan rantai yang teratur dan tetap. Enzim memegang peranan penting dalam berbagai reaksi di dalam sel. Sebagai protein, enzim diproduksi dan digunakan oleh sel hidup untuk mengkatalisis reaksi, antara lain konversi energi dan metabolisme pertahanan sel (Anonim, 2011). Enzim meningkatkan laju reaksi sehingga terbentuk kesetimbangan kimia antara produk dan pereaksi. Pada keadaaan kesetimbangan, istilah pereaksi dan produk tidaklah pasti dan bergantung pada pandangan kita. Dalam keadaan fisiologi yang normal, suatu enzim tidak mempengaruhi jumlah produk dan pereaksi yang sebenarnya dicapai tanpa kehadiran enzim. Jadi, jika keadaan kesetimbangan tidak menguntungkan bagi pembentukan senyawa, enzim tidak dapat mengubahnya (Salisbury, 1995).

Suatu enzim dapat mempercepat reaksi 108 sampai 1011 kali lebih cepat daripada apabila reaksi tersebut dilakukan tanpa katalis. Jadi enzim dapat berfungsi sebagai katalis yang sangat efisien, disamping itu mempunyai derajat kekhasan yang tinggi. Seperti juga katalis lainnya, maka enzim dapat menurunkan energi aktiasi suatu reaksi enzim dapat menurunkan energi aktivasi suatu reaksi kimia. Reaksi kimia ada membutuhkan energi atau mengeluarkan energi (Poedjadi, 2006).

Cairan ludah adalah secretion1 eksokrin, 2 consistingof sekitar 99% air, yang mengandung berbagai elektrolit (natrium, kalium, kalsium, klorida, magnesium, bikarbonat, fosfat) dan protein, yang diwakili oleh enzim, immunoglobulin dan faktor antimikroba lainnya, glikoprotein mukosa, jejak albumin dan beberapa polipeptida dan oligopeptida yang penting bagi kesehatan mulut. Ada juga glukosa dan produk nitrogen, seperti urea dan ammonia.3, 4 Komponen berinteraksi dan bertanggung jawab atas berbagai fungsi dikaitkan dengan air liur. Air liur bertanggung jawab untuk pencernaan awal pati, mendukung pembentukan, makanan bolus.13 17 Tindakan ini terjadi terutama oleh adanya enzim pencernaan α-amilase (ptyalin) dalam komposisi air liur. Fungsi biologis adalah untuk membagi pati menjadi maltosa, maltotriosa, dan dekstrin. Enzim ini dianggap baik indikator kelenjar ludah berfungsi, 29 kontribusi 40% sampai 50% dari jumlah ludah protein yang dihasilkan oleh kelenjar. Semakin besar bagian dari enzim (80%) disintesis dalam parotids dan sisanya di submandibula kelenjar. Aksinya tidak aktif di bagian asam dari saluran pencernaan dan akibatnya terbatas pada mulut (Almeida, 2008).

Pengukuran aktivitas amilase dan glukanase dilakukan berdasar kepada kemampuan enzim tersebut dalam mengurai substrat (polisakarida) menjadi monosakarida dalam bentuk gula pereduksi, pada satuan waktu tertentu. Akurasi pengukuran dapat dicapai bila proses deteksi gula pereduksi berlangsung optimum. Reagen DNS yang digunakan dalam mengukur gula pereduksi terdiri dari asam dinitrosalisilat, garam Rochelle dan natrium hidroksida (Rahmansyah, 2003).

Faktor-faktor yang dapat mempengaruhi fungsi enzim diantaranya adalah (Dwidjoseputro, 1992) :

  1.  suhu

Oleh karena reaksi kimia itu dapat dipengaruhi suhu maka reaksi menggunakan katalis enzim dapat dipengaruhi oleh suhu. Di samping itu, karena enzim adalah suatu protein maka kenaikan suhu dapat menyebabkan denaturasi dan bagian aktig enzim akan terganggu sehingga konsentrasi dan kecepatan enzim berkurang.

b.      pH

Umumnya enzim efektifitas maksimum pada pH optimum, yang lazimnya berkisar antara pH 4,5-8.0. Pada pH yang terlalu tinggi atau terlalu rendah umumnya enzim menjadi non aktif secara irreversibel karena menjadi denaturasi protein.

c.       konsentrasi enzim

Seperti pada katalis lain, kecepatan suatu reaksi yang menggunakan enzim tergantung pada konsentrasi enzim tersebut. Pada suatu konsentrasi substrat tertentu, kecepatan reaksibertambah dengan bertambahnya konsentrasi enzim.

d.      konsentrasi substrat

Hasil eksperimen menunjukkan bahwa dengan konsentrasi substrat akan menaikkan kecepat reaksi. Akan tetapi, pada batas tertentu tidak terjadi kecepatan reaksi, walaupn konsenrasi substrat diperbesar.

e.       zat-zat penghambat

Hambatan atau inhibisi suatu reaksi akan berpengaruh terhadap penggabungan substrat pada bagian aktif yang mengalami hambatan.
Suatu enzim hanya dapat bekerja spesifik pada suatu substrat untuk suatu perubahan tertentu. Misalnya, sukrase akan menguraikan rafinosa menjadi melibiosa dan fruktosa, sedangkan oleh emulsin, rafinosa tersebut akan terurai menjadi sukrosa dan galaktosa (Salisbury dan Ross, 1995).

 

C.      ALAT DAN BAHAN

a)      Alat

Alat yang digunakan yaitu :

  1. Tabung reaksi
  2. Pipet tetes
  3. Timbangan analitik
  4. Gelas kimia 50 ml
  5. Erlenmeyer
  6. Gelas ukur 50 ml
  7. Batang pengaduk
  8. Cawan petri
  9. Penangas air
  10. Tissue
  11. Spektrofotometer
  12. Kuvet
  13. Corong
  14. Gegep
  15. Kertas label

 

b)      Bahan

Bahan yang digunakan yaitu :

  1. Saliva
  2. NaOH
  3. Reagen DNS
  4. H2SO4 2M
  5. Akuades
  6. Pati 4%

 

 

D.      PROSEDUR KERJA

a)      Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Enzim Amilase.

 

Pati

-          Ditimbang 0,04 gram

-          Diencerkan dengan akuades hingga 10 ml

-          Dipipet masing-masing 0,5 ml

-          Dimasukan ke dalam tabung I,II, dan III

-          Ditambahkan akuades masing-masing 0,5 ml

-          Ditambahkan saliva masing-masing 1 ml

-          Diinkubasi masing-masing pada suhu 4; 37; 80 oC

-          Ditambahkan pereaksi DNS masing-masing 1 ml

-          Dikocok

-          Dipanaskan

-          Didinginkan dalam air dingin

-          Ditambahkan 8 ml akuades pada masing-masing tabung

-          Dikocok

-          Diukur absobansinya

Hasil ..?

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

b)      Pengaruh Konsentrasi Substrat Terhadap Aktivitas Enzim

 

 

-          Ditimbang 0,04 gram

-          Diencerkan dengan akuades hingga 10 ml

-          Dipipet masing-masing 1; 0,5; 0 ml

-          Dimasukan ke dalam tabung I,II, dan III

-          Ditambahkan akuades masing-masing 0;  0,5; 1 ml

-          Ditambahkan saliva masing-masing 1 ml

-          Diinkubasi masing-masing pada suhu 60 oC selama 15 menit

-          Ditambahkan pereaksi DNS masing-masing 1 ml

-          Dikocok

-          Dipanaskan selama 15 menit

-          Didinginkan dalam air dingin

-          Ditambahkan 8 ml akuades pada masing-masing tabung

-          Dikocok

-          Diukur absobansinya

Hasil ..?

Pati

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

c)      Pengaruh pH terhadap aktivitas amilase

 

 

 

-          Ditimbang 0,04 gram

-          Diencerkan dengan akuades hingga 10 ml

-          Dipipet masing-masing 1; 0,5; 0 ml

-          Dimasukan ke dalam tabung I,II, dan III

-          Ditambahkan akuades masing-masing 0;  0,5; 1 ml

-          Ditambahkan saliva masing-masing 1 ml

-          Diinkubasi masing-masing pada suhu 60 oC selama 15 menit

-          Ditambahkan pereaksi DNS masing-masing 1 ml

-          Dikocok

-          Dipanaskan selama 15 menit

-          Didinginkan dalam air dingin

-          Ditambahkan 8 ml akuades pada masing-masing tabung

-          Dikocok

-          Diukur absobansinya

Hasil ..?

Pati

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

d)     Pengaruh Waktu Inkubasi Terhadap Aktivitas Amilase

 

 

 

-          Ditimbang 0,04 gram

-          Diencerkan dengan akuades hingga 10 ml

-          Dipipet masing-masing 1; 0,5; 0 ml

-          Dimasukan ke dalam tabung I,II, dan III

-          Ditambahkan akuades 0; 0,5; 1 ml

-          Ditambahkan saliva masing-masing 1 ml

-          Diinkubasi masing-masing pada suhu 37 oC pada waktu 0, 30 dan 60 menit

-          Dipipet 1 ml

-          Dimasukan ketabung

-          Ditambahkan pereaksi DNS masing-masing 1 ml

-          Dikocok

-          Dipanaskan selam 30 menit

-          Didinginkan dalam air dingin

-          Ditambahkan 8 ml akuades pada masing-masing tabung

-          Dikocok

-          Diukur absobansinya

Hasil ..?

Pati

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

e)      Larutan blanko

 

-          Dipipet

-          Dimasukan ke tabung reaksi

-          Ditambahkan 1 ml pereaksi DNS

-          Dipanaskan

-          Didinginkan

-          Ditambahkan 8 ml akuades

-          Dimasukan ke kuvet

-          Diukur absorbansinya

1 ml akuades

Hasil..?

 

 

E.     HASIL PENGAMATAN

1)      Tabel Hasil Pengamatan.

a)      Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Enzim

 

Tabung Pati 4% Air (ml) Saliva (ml) Suhu inkubasi (oC) Hasil λ
1 0,5 0,5 1 4 Orange 0,17
2 0,5 0,5 1 37 Orange 0,02
3 0,5 0,5 1 80 Orange 0.016

b)     Pengaruh Konsentrasi Substrat Terhadap Aktivitas Enzim

 

Tabung Pati 4% (ml) Air (ml) Saliva (ml) Absorbansi Konsentrasi
1 1 0 1 0,250 0,63 mol/l
2 0,5 0,5 1 0,126 3,19 mol/l
3 0 1 1 0,192 4,87mol/l

 

 

 

c)      Pengaruh Waktu Inkubasi Terhadap Aktivitas Enzim

 

Tabung Waktu Inkubasi (menit) Absorbansi
1 0 0,06
2 30 0,202
3 60 0,61

 

 

 

d)     Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Enzim

No. Sampel Absorbansi
1. Tabung I (Air) 0,061 A
2. Tabung II (+NaOH) 0,027 A
3. Tabung III (+H2SO4) -0,072 A

 

 

 

e)      Tabel standar glukosa

 

Glukosa mg/ml 0 2 4 6 8 10
Absorbansi 0 0,078 0,134 0,285 0,294 0,390

 

2)      Kurva Standar Glukosa

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3)      Perhitungan konsentrasi substrat

 

Dari kurva diperoleh persamaan : y = 0,0393x + 0,0005, sehingga :

 

  1. Untuk absorbansi 0,250 A, konsentrasi amilasennya adalah :

0,250=0,0393x+0,0005

x= 0,250-0,00050,0393

x=6,34 mg/ml

 konsentrasi substrat pada absorbansi 0,250 A adalah 6,34 mg/ml

 

  1. Untuk absorbansi 0,126 A, konsentrasi amilasennya adalah :

0,126=0,0393x+0,0005

x= 0,126-0,00050,393

x=3,19 mol/l

 konsentrasi substrat pada absorbansi 0,126 A adalah 3,19 mol/l

 

  1. Untuk absorbansi 0,192 A, konsentrasi amilasennya adalah :

0,126=0,0393x+0,0005

x= 0,192-0,00050,393

x=4,87 mol/l

 konsentrasi substrat pada absorbansi 0,126 A adalah 4,87 mol/l

 

F.       PEMBAHASAN

Pati merupakan jenis polisakarida yang tersusun atas amilosa dan amilopektin. Perbedaan amilosa dna amilopektin terletak pada ikatan OH glikosidik penyusunnya. Dalam tubuh manusia, pemecahan karbohidrat pertama kali terjadi pada mulut, dimana pada mulut terdapat air liur yang mengandung enzim amilase. Enzim amilase khususnya enzim  amilase merupakan enzim yang dapat memecah pati menjadi glukosa dengan memutuskan ikatan glikosidik penyusun pati. Glukosa hasil hidrolisis ini digunakan oleh tubuh sebagai sumber energi utama. Enzim bersifat sebagai biokatalisator reaksi kimia, dimana enzim dapat mempercepat reaksi kimia dengan energi yang tidak sebanyak kebutuhan energi pada reaksi tanpa enzim. Kecepatan reaksi enzim ini dipengaruhi oleh beberapa faktor dan beberapa diantaranya yaitu pH, konsentrasi dan suhu.

Pada percobaan ini dilakukan pengujian aktivitas enzim amilase pada saliva  terhadap pH, suhu, konsentrasi substrat, dan waktu inkubasi yang dibuat bervariasi. Percobaan ini diawali dengan pengenceran pati dengan menggunakan akuades, setelah itu dicampurkan dengan sejumlah saliva lalu diinkubasi. Reaksi enzimatis terjadi pada saat larutan diinkubasi pada suhu tertentu. Hasil inkubasi ditambahkan sejumlah indikator DNS dan dipanaskan. Fungsi penambahan DNS adalah untuk memberikan reaksi kompleks yang membantu dalam pengukuran absorbansi larutan pada spektrofotometer dan berfungsi menghentikan kerja enzim, sehingga enzim tidak memecah pati. Tujuan pemanasan adalah untuk mengoptimalkan kerja DNS dan mempercepat reaksi dari DNS untuk menghentikan kerja enzim.  Hasil pemanasan kemudian didinginkan, dimana tujuan pendinginan untuk menghilangkan DNS yang telah digunakan untuk menghentikan reaksi asam sulfat.  Lalu larutan diencerkan dengan sejumlah akuades yang bertujuan untuk mengurangi intensitas warna dari indikator DNS agar diperoleh hasil yang akurat dan diukur absorbansi larutan.

Prinsip kerja dari pengujian aktivitas enzim ini yaitu menggunakan faktor-faktor yang mempengaruhi kerja enzim untuk menguji aktivitas kerja enzim amilase saliva terhadap pati sagu. Pengukuran ini berdasarkan pada perubahan laju reaksi yang ditunjukan enzim amilase terhadap pH, konsentrasi, suhu dan waktu inkubasi yang dibat bervariasi. Laju reaksi sebanding dengan konsentrasi sehingga aktivitas enzim amilase dapat ditinjau dari konsentrasi atau kadar dari enzim setelah diberikan perlakuan.

Uji pertama yaitu uji pengaruh konsentrasi substrat terhadap aktivitas enzim amilase. Seperti yang diketahui, konsentrasi substrat dapat mempengaruhi kerja enzim, dimana hubungan konsetrasi terhadap kerja enzim berbanding lurus. Dengan kata lain, tingginya konsentrasi substrat akan meninggikan aktivitas enzim. Pada literatur dijelaskan bila jumlah enzim dalam keadaan tetap, kecepatan reaksi akan meningkat dengan adanya peningkatan konsentrasi substrat. Namun, pada tabel data hasil percobaan, konsentrasi yang diperoleh dari hasil plot glukosa standar tidak sebanding dengan banyak ml pati yang digunakan pada reaksi enzimatis ini. Pada pati 1 ml memiliki kadar amilase yang lebih rendah dibandingkan pada pati 0%. Dimana seharusnya kadar amilase meningkat dengan semakin banyaknya jumlah gram substrat yang digunakan. Hal ini dapat dipengaruhi oleh kualitas pati yang tidak 100% pati dan kesalahan data ini dapat pula disebabkan oleh kelalaian praktikan pada saat pelabelan larutan yang akan diabsorbansi.

Selanjutnya dilakukan pengujiaan pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim. Seperti yang diketahui, enzim tersusun atas asama amino sehingga sifat kimia dan fisiknya akan diturunkan dari asam amino. Pada suhu rendah enzim tidak aktif sehingga tidak dapat bereaksi dengan substrat sedangkan pada suhu tinggi enzim akan mengalami kerusakan pada sisi aktifnya atau terdenaturasi. Pada literatur disebutkan suhu optimum enzim yaitu 30-40oC dan akan mengalami denaturasi diatas suhu 60oC. Berdasarkan hal tersebut, maka seharusnya hasil yang diperoleh pada percobaan ini adalah absorbansi dan konsentrasi amilase pada suhu 37oC akan lebih besar bila dibandingkan dengan absorbansi dan konsentrasi amilase pada suhu 4 dan 80 oC. Namun, pada tabel hubungan suhu terhadap kadar, pada suhu 4oC lah kerja enzim meningkat yang ditandai dengan tingginya kadar amilase yang diperoleh dan kerja enzim menurun seiring bertambahnya suhu hingga mencapai suhu 80oC. Pada suhu 80oC, enzim akan mengalami kerusakan struktur sekunder, tersier dan kuarter pada area sisi aktifnya sehingga tidak dapat berikatan dengan substrat dan frekuensi tumbukan antar partikel berkurang oleh kerusakan enzim ini sehingga menurunkan laju reaksi enzim.

Pada data hasil pengujian pengaruh pH terhadap aktivitas enzim terlihat yaitu pada sampel yang ditambahkan sejumlah air memiliki absorbansi yang lebih tinggi dibandingkan absorbansi yang dihasilkan dari penambahan NaOH dan H2SO4. Hasil ini telah sesuai dengan teori. Enzim akan optimum kerjanya apabila berada pada suhu netral. Air merupakan senyawa dengan pH netral yaitu kurang lebih pH=7, sedangkan NaOH dan H2SO4 merupakan senyawa basa dan asam. Menurut arrhenius, dikatakan asam apabila dilarutkan dalam air akan mneghasilkan H+ sedangkan dikatakan basa apabila dilarutkan dalam air menghasilkan OH-. Pada suasana asam atau basa, aktivitas enzim akan menurun yang disebabkan oleh rusaknya sisi aktif enzim pengaruh ion H+ atau OH- dari senyawa asam dan basa. Ion-ion ini yang mempengaruhi gugus alkil dari asam amino penyusun enzim. Seperti yang diketahui, asam amino tersusun atas gugus amino, gugus alkil, gugus karboksil dan atom H. Berdasarkan gugus alkilnya (R) asam amino diklasifikasikan menjadi beberapa jenis dan salah satunya yaitu asam dan basa. Maka ketika asam atau basa ditambahkan pada larutan yang mengandung asam amino maka gugus alkil (R) asam amino yang bersifat asam-basa akan meberikatan dengan H – OH dari asam basa yang ditambahkan. Tentu saja gugus alkil (R) asam amino yang bersifat asam akan berikatan dengan OH- yang diperoleh dari basa yang ditambahkan, begitu pula dengan ketika bagian alkil asam amino yang bersifat basa bertemu dengan H+ dari asam yang ditambahkan. ikatan yang dibentuk inilah yang merubah sisi aktif dari enzim sehingga frekuensi tumbukan partikel berkurang yang menyebabkan laju reaksi enzim lemah atau rendah.

Uji terakhir yaitu pengaruh waktu inkubasi terhadap aktivitas amilase. Enzim mulai bekerja pada saat diinkubasi. Semakin lama waktu inkubasi semakin efektif kerja dari enzim, namun tidak selamanya semakin lama waktu inkubasi dapat meningkatkan kerja enzim. Enzim akan berhenti bekerja apabila telah mencapai masa jenuhnya. Masa jenuh ini terjadi apabila enzim telah berikatan dengan substrat. pada tabel hasil percobaan waktu terhadap kadar menunjukan dari waktu 0 menit sampai 60 menit terjadi peningkatan kerja enzim. Pada waktu 0 menit, tumbukan partikel baru dimulai sehingga frekuensi tumbukan masih berkurang namun seiiring bertambahnya waktu tumbukan akan semakin kuat karena adanya gerakan zigzag atau dalam istilah koloid gerak brown yang terjadi pada partikel. Gsemakin besar frekuensi tumbukan yang terjadi memperbesar laju reaksi enzim.

 

 

G.      KESIMPULAN

Berdasarkan hasil percobaan dapat disimpulkan bahwa aktivitas enzim dipengaruhi oleh pH, suhu, waktu inkubasi dan konsentrasi substrat. Untuk menguji aktivitas enzim dapat dilakukan dengan menggunakan pereaksi DNS.

 

DAFTAR PUSTAKA

 

Almeida. P.D.V.D., Gregio. AMT., Macahado. M.A.N., Soares de lima. A.A., Luciana.R.A. 2008. Saliva Compesition and Function : A comprehensive Review. Journal of Comtemporary Dental Practice. Vol.9. No.3.

 

Anonim, 2011, Enzim, http://id.shvoong.com/exact-sciences/biochemistry/2200855-jenis-jenis-enzim/#ixzz1gXpopTUI, diakses pada tanggal 29 November 2012.

 

 

Murray, R.K., Daryl K.G., Victor W.R., 2009, Biokimia Harper Edisi 27, EGC, Jakarta.

Poedjadi, A., F.M Titin.S., 2006. Dasar-Dasar Biokimia. UI-Press. Jakarta.

 

Rahmansyah. M., I Made. S. 2003. Optimasi Analisis Amilase dan Glukanase Yang Diekstrak Dari Miselium Pleutotus ostrerotus Dengan Asam 3,5 Dinitrosalisilat. Jurnal Penelitian. Vol.9. No.7.

 

Salisbury, F.B., dan C.W. Ross, 1995, Fisiologi Tumbuhan Jilid 2, ITB Press, Bandung.

 

Sukandar.U., Achmad. AS., Lindawati., Yadi.T. 2011. Sakarifikasi Pati Ubi Kayu Menggunakan Amilase Aspergilus Niger ITB CCL74. Jurnal Teknik Kimia Indonesia. Vol. 10 No. 1.

 

 

About these ads

Berikan Balasan

Isikan data di bawah atau klik salah satu ikon untuk log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Logout / Ubah )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Logout / Ubah )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Logout / Ubah )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Logout / Ubah )

Connecting to %s